Möglichkeiten und Grenzen verschiedener Labor-Methoden
Von Dr. Peter Kopp, Institut für klinische Prüfung Ludwigsburg GmbH, Veterinärmedizinisches Labor

Wie jedes Jahr im Frühsommer ist jetzt die erste Zeckenwelle in vollem Gange. Und wie immer um diese Jahreszeit bringen die Hunde eine Vielzahl an Zecken von ihren Spaziergängen mit nach Hause. Seit das Wissen auch in der breiten Bevölkerung über die gesundheitliche Gefährdung durch Zeckenstiche beim Menschen, vor allem durch die FSME oder die Borreliose, wächst, steigt auch die Angst über eine mögliche Gefährdung der Hunde durch die entsprechenden Erreger.

Dieser Artikel soll einen kurzen Überblick über labormedizinische Verfahren, deren richtigen Einsatzbereich sowie die Grenzen der einzelnen Verfahren aufzeigen.

Borrelia (B.) burgdorferi, der Erreger der Lyme-Borreliose, hat den Namen nach seinem Entdecker W. Burgdorfer, der zusammen mit dem Rheumatologen A. Steere Anfang der achtziger Jahre dieses Bakterium aus Zecken in der Umgebung der Gemeinde Lyme in Connecticut, USA, isolieren konnte. Der Hintergrund dieser intensiven Forschung war ein gehäuftes Auftreten von Arthritiden vor allem bei Kindern in diesem Gebiet.

Mit der Kenntnis dieser Fakten ist man auch schon bei zwei wesentlichen Problempunkten bezüglich der Borrelien-Diagnostik beim Hund:

1. Viele der "Erkenntnisse" der Borreliose beim Hund wurden direkt vom Wissen aus der Humanmedizin abgeleitet
und
2. Viele dieser Kenntnisse stammen aus den USA.

Beides ist im Prinzip nicht falsch, bedarf aber einer kritischen Betrachtung.

Zu 1.: In der Humanmedizin haben seit der Entdeckung von B. burgdorferi intensive Forschungen vor allem im Bereich der Epidemiologie und zur Aufklärung des klinischen Krankheitsbildes sowie deren frühzeitige Erkennung und Therapie stattgefunden. Man konnte nachvollziehen, dass die Borrelien durch den Zeckenstich übertragen werden und sich dann anschliessend in verschiedenen Organsystemen (zum Beispiel Haut, Gelenke, Zentral-Nerven-System) manifestierten.

Es wurde aus Erfahrungen mit dem Erreger der Syphillis, Treponema pallidum, der in dieselbe Gruppe der Bakterien gehört wie B. burgdorferi, ein dreistufiger Verlauf der Lyme Borreliose postuliert. Im ersten Stadium reagiert der Mensch mit Allgemeinsyptomen wie Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, Fieber, Myalgien u. a. m. und häufig ist um die Bissstelle eine sog. Wanderröte, das Erythema migrans (EM), zu erkennen. Im zweiten Stadium werden neurologische, kardiale, arthrogene oder ophtalmologische Symptome beobachtet. Im letzten Stadium reagiert der Mensch unter anderem mit einer chronischen Arthritis, einer chronischen Enzephalitis oder der so genannten Acrodermatitis chronica athrophicans (ACA), einer Erkrankung, bei der die Haut sich pergamentartig verändert.

Diese Aufzählung zeigt schon, wie komplex und vielseitig das Erscheinungsbild der Lyme-Borreliose beim Menschen sein kann. Genauso vielseitig sind die Krankheitsbilder, die beim Hund im Zusammenhang mit der Borreliose beschrieben werden. Allerdings halten nur wenige dieser Berichte einer genaueren wissenschaftlichen Betrachtung stand. Aus der Humanmedizin bekannte Syptome einer Borreliose auf den Hund zu übertragen und bei positiver Serologie die Schlussfolgerung zu ziehen, dass ein direkter Zusammenhang besteht, bedarf einer genauen Abklärung sämtlicher anderer in Frage kommenden Ursachen.

Zu 2.: Wie zweite angesprochene Problematik besteht darin, dass man seit einigen Jahren weiss, dass von B. burgdorferi mehrere unterschiedliche Genospezies existieren. Man spricht daher heute von B. burgdorferi sensu lato, die sich unter anderem in B. burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sowie Borrelia afzelii aufteilt.

Das Interessante daran ist, dass man in den USA hauptsächlich B. burgdorferi sensu stricto isolieren konnte. Im Gegensatz dazu werden in Europa alle drei genannten Genospezies isoliert. Da in den USA das am häufigsten beobachtete Symptom der Lyme-Borreliose die Arthritis ist, geht man heute davon aus, dass B. burgdorferi sensu stricto einen Organtropismus für den Bewegungsapparat besitzt, Borrelia garinii eher disseminierte Formen der Borreliose verursacht bzw. die Neuroborreliose hervorruft und Borrelia afzelii eine Affinität zur Haut hat und Symptome wie das EM oder die ACA hervorruft.

Selbstverständlich sind die unterschiedlichen Genospezies auch unterschiedlich in ihrer antigenen Struktur, was natürlich nicht nur Probleme in der serologischen Diagnostik sondern auch in der Entwicklung von Impfstoffen verursacht. Deshalb sind Entwicklungen von Testsystemen (v.a. von ELISA`s), oder gar Impfstoffen in den USA nicht ohne weiteres in Europa anzuwenden.

Was ist derzeit über die Borreliose beim Hund bekannt?

Erst 1992 gelang es Wasmoen et al. nachzuweisen, dass B. burgdorferi beim Hund die Kochschen Postulate erfüllt. Sie konnten Hunde experimentell infizieren (wobei die Hunde mit gestörtem Allgemeinbefinden, Gelenkssyptomen und Fieber reagierten), den Erreger anschliessend aus den erkrankten Tieren isolieren und damit erneut eine Erkrankung bei anderen Hunden hervorrufen. Allerdings entsprach die Art der Infektion nicht dem natürlichen Infektionsweg (hochdosierte i.v.-Gabe von B. burgdorferi in Reinkultur über sieben Tage).

Differenzierter waren die Infektionsversuche von Appel et al. (1993). Sie infizierten die Hunde über den Vektor Zecke, indem sie Hunden mit Borrelien infizierte Zecken anhefteten. Sie konnten dabei folgendes beobachten: Das dominierende klinische Bild, das die Hunde zeigten, waren Lahmheiten. Diese Lahmheiten entwickelten sich zwischen zwei und fünf Monaten nach Infektion über die Zecken. Dabei zeigten die Tiere zuerst leichte Lahmheiten, die innerhalb von drei Tagen zunahmen und nach vier Tagen wieder verschwunden waren.

Hauptsächlich waren davon die Ellenbogengelenke sowie die Karpal- und Kniegelenke betroffen. Palpatorisch konnte bei einigen Tieren eine leichte Schwellung sowie eine lokale Temperaturerhöhung festgestellt werden. Die meisten der an Lahmheiten erkrankten Hunde zeigten eine erhöhte Körpertemperatur (39,5 - 40° C) und waren apathisch. Gewichtsverluste konnten dabei nicht beobachtet werden.

Nach der ersten Lahmheit entwickelten die meisten der Tiere eine zweite , teilweise eine dritte Lahmheit im Abstand von zwei bis vier Wochen. Dabei waren teilweise andere Gelenke als in der ersten Periode betroffen. Ausser diesen Symptomen zeigten die Tiere innerhalb der Beobachtungsperiode von 17 Monaten keine anderen klinischen Anzeichen mehr. Ein EM konnte auch nach sorgfältigster Betrachtung der Einstichstelle nicht beobachtet werden. Die von anderen Autoren beschriebenen Erkrankungen wie Nierenfunktionsstörungen (Grauer et al., 1988) oder Herzblock (Levy und Duray, 1988) bestätigten sich auch in der anschliessenden Sektion der Versuchshunde nicht.

Die von Appel et al. angeführten Untersuchungen wurden in den USA durchgeführt, sodass man auch hier von der Vermutung ausgehen muss, dass es sich primär um B. burgdorferi sensu stricto-Stämme gehandelt hat. Ähnliche Infektionsversuche mit B. afzelii oder B. garinii wurden beim Hund bisher nicht durchgeführt.

Verschiedene Labormethoden und deren Grenzen

Bei allen Labormethoden bezüglich der Borreliose beim Hund muss man beachten, dass die Ergebnisse lediglich Hilfsmittel zur Diagnosestellung sein können und auf keinen Fall eine sorgfältige klinische Untersuchung unter Abklärung der in Frage kommenden Differentialdiagnosen ersetzen können.

Prinzipiell unterscheidet man zwischen:

A) Direkten Verfahren
1.) Anzucht der Borrelien, zum Beispiel aus Synovia
2.) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (im engeren Sinne kein direktes Nachweisverfahren, da lediglich DNA nachgewiesen wird und keine Aussage über die Vitalität des Erregers gemacht werden kann)

B) Indirekten Verfahren des Erregernachweises = Serologie
1.) Indirekter Hämagglutinationstest (IHA)
2.) Immunfluoreszenstest (IFT)
3.) Enzym-Immunoassay (EIA)
4.) Western- bzw. Immunoblot

A) Direkte Verfahren:

Anzucht der Borrelien: Die Anzucht der Borrelien aus den betroffenen Regionen oder Organen gelingt sehr selten und ist zudem noch sehr langwierig. Man benötigt dazu ein Spezial-Nährmedium (BSK-II) und muss dieses bis zu 5 Wochen bebrüten. Burmester et al. (1997) gehen bei der Anzucht aus Blut, oder Synovia von einer Isolationsrate von maximal zehn Prozent aus. Ebenso schwierig ist folglich eine direkte Anfärbung des Erregers (zum Beispiel mittels Silberfärbung). In seltenen Fällen kann man evtl. mit Hilfe der Dunkelfeld- Mikroskopie die Borrelien direkt nachweisen, wobei auf die Problematik von Artefakten bzw. verwandten Bakterien hinzuweisen ist).

Polymerase-Kettenreaktion (PCR):
Die in den letzten Jahren immer populärer werdende PCR als sensitive Nachweismethode bei vielen Infektionskrankheiten, kann nur unter Vorbehalt bei der Borreliose eingesetzt werden, da man bisher immer noch recht wenig über den Aufenthalt der Borrelien in den einzelnen Stadien der Erkrankung oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem Zeckenstich weiss. Berichte über den Nachweis von Borrelien mittels PCR aus dem Urin von Hunden sind nur bedingt verwertbar, da eine genaue Aussage zu welchen Zeitpunkt die Borrelien ausgeschieden werden, nicht möglich ist.

In der Humanmedizin wird dieser Nachweis als Erfolgskontrolle bei einer Antibiotika-Therapie eingesetzt. Auch Berichte mittels PCR Borrelien in der Haut nachzuweisen sind vorsichtig zu bewerten, da dieser Nachweis hauptsächlich bei experimentell infizierten Hunden geführt wurde und deshalb die Einstichstelle der Zecke klar definiert war. In der Humanmedizin wird die PCR bisher nur als ergänzende Methode bei unklarer Serologie und klar definiertem klinischen Bild (zum Beispiel bei der Neuroborreliose) empfohlen.

Aufgrund der angefürten Problematik beim direkten Erregernachweis dient die Serologie zur Zeit noch als Methode der Wahl, um eine Borreliose zu diagnostizieren.

B) Indirekte Verfahren = Serologie

Indirekter Hämagglutinationstest (IHA): Der indirekte Hämagglutinationstest (IHA) eignet sich aufgrund der Einfachheit gut zum Screening. Dabei werden mit Borrelienantigen beladene Schaferytrozyten mit Patientenserum inkubiert. Im positiven Fall kommt es zur Bildung eines klassischen Antigen-Antikörperkomplexes und dadurch zur Agglutionation der Antikörper. Immunfloureszenztest (IFT) und Enzym-Immunoassay (EIA): Der Immunfluoreszenstest (IFT) erfordert zwar eine grössere Erfahrung des Untersuchers als z.B. der Enzymimmunoassay (EIA), Untersuchungen haben aber gezeigt, dass bei richtiger Anwendung sowohl bezüglich der Sensitivität als auch der Spezifität keine Unterschiede zum EIA bestehen.

Der IFT gilt als besonders geeignet für Screenings, wobei natürlich auch hier wieder wichtig zu wissen ist, wann welche Antikörpertiter (IgM bzw. IgG) nach Zeckenexposition zu erwarten sind. Auch hierzu gibt es in der Literatur wieder unterschiedliche Angaben wobei dies einmal mit der oft unklaren Anamnese bei natürlicher Exposition zusammenhängt, zum anderen aber auch damit, dass man festgestellt hat, dass ein deutlicher Unterschied bezüglich der Qualität und des Zeitpunktes der Antikörperantwort bei experimentell infizierten Hunden (i.v.- Infektion zum einem sowie die Infektion über den Vektor Zecke zum anderen) besteht. Appel et al. (1993) konnten in ihren bereits oben angeführten Studien eine sich langsamer entwickelnde, aber länger andauernde Antikörperbildung erkennen.

Alle Hunde, die infizierten Zecken ausgesetzt waren, bildeten vier bis sechs Wochen nach Zeckenstich nachweisbare Antikörpertiter (IgG) aus, wobei diese innerhalb der nächsten sechs bis acht Wochen anstiegen und mindestens ein Jahr auf diesem hohen Niveau bestehen blieben. Wie sich der Titerverlauf bei IgM verhält, ist nicht endgültig geklärt. Zu erwarten ist, da es sich bei IgM um die Immungloboline der frühen Phase einer Infektion handelt, dass ein positiver Titer früher als bei IgG nachzuweisen ist. Burgess (1988) gibt an, dass sich innerhalb der ersten vier Wochen bereits ein deutlicher IgM-Titer ausbildet.

Allerdings gibt es auch Hinweise in der Literatur, dass sich deutliche IgM - Titer nur bei Erstinfektion (und v.a. bei Hautmanifestationen) nicht aber bei Reinfektionen ausbilden. Kontrovers wird auch die Frage diskutiert, ob man bei serologischen Untersuchungen grundsätzlich mit antigen verwandten Bakterien (zum Beispiel Treponema phagedenis) absorbieren muss, um eventuelle Kreuzreaktionen auszuschliessen.

Bekannt ist, dass antigen Verwandte Bakterien aus der Ordnung der Spirochaetales (zum Beispiel Leptospira spp. oder Treponema spp.) zu Kreuzreaktionen führen können. Da man vermutet, dass vor allem in der frühen Phase eine Borrelieninfektion oft starke Reaktionen mit den gemeinsamen Antigenen stattfinden, deshalb könnte unter Umständen eine vorherige Absorption diese Reaktion unterdrücken.

Sinnvoller scheint daher die Kombination mit einem Western- bzw. Immunoblot: als Bestätigungstest. Dazu werden die Antigene von B. burgdorferi mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferriert. Diese wird mit dem Patientenserum inkubiert und anschliessend wird die Reaktion des Serums, bzw. der Antikörper im Serum, mittels Substratfärbung sichtbar gemacht.

Es entstehen dabei im positive Falle unterschiedliche Banden, die nach ihrer Spezifität für B. burgdorferi interpretiert werden müssen. Dies erfordert einige Erfahrung des Untersuchers und ist auch von dem verwendeten Borrelien-Stamm abhängig. Blenk (1993) gibt in der Humanmedizin folgende Indikationen für den Einsatz des Immunoblots an:

• Bei eindeutigem klinischen Bild und negativer Serologie (spielt v.a. in der Humanmedizin eine Rolle, da beim EM oft kein hoher Antikörper-Titer (IgG) im Blut diagnostiziert werden kann),
  
• Bei unklarem klinischen Bild und grenzwertigem IFT (1:40 bis 1:80), um zwischen unspezifischer Reaktion, anamnestischen Erregerkontakt oder aktiver Borreliose unterscheiden zu können,
  
• Bei fehlender klinischer Symptomatik, aber eindeutigem anamnestischen Hinweis (hat bei der Häufigkeit von Zeckenstichen beim Hund in der Veterinärmedizin eher keine Bedeutung),
  
• Zur Abklärung, ob noch eine aktive chronische Infektion nach vorangegangener Antibiose vorliegt. (Neuere Untersuchungen beim Hund (Straubinger et al. 1997) geben Anlass zur Diskussion, ob durch antibiotische Behandlung überhaupt eine Elimination des Erregers erreicht werden kann und ob sich die Borrelien nicht vielleicht in schlecht vaskularisierten Geweben, zum Beispiel Gelenken, oder intrazellulär "verstecken" um so über Jahre oder eventuell lebenslang im Organismus zu persistieren. Sie konnten zwar die Arthritiden erfolgreich therapieren, hatten auch nach 30-tägiger Antibiotikabehandlung auch eine deutliche Reduzierung der Antikörpertiter, teilweise bis unter die Nachweisgrenze, aber sechs Monate nach der Behandlung waren wieder Antikörper gegen B. burgdorferi nachweisbar.) Übertragen auf die Veterinärmedizin scheint der Einsatz des Immunoblots vor allem bei grenzwertigen bzw. niederen Titern sinnvoll zu sein, um unspezifische Reaktionen ausschliessen zu können. Auch bei klarem klinischen Bild (nach Abklärung der in Frage kommenden Differentilaldiagnosen) und negativer Serologie wäre ein Immunoblot sinnvoll.

Zusammenfassung

Die oben gemachten Ausführungen zeigen, dass die Borrelien-Diagnostik ein schwieriges Gebiet ist. Wenn man jetzt den Durchseuchungsgrad der Zecken in Deutschland (Vermutungen gehen von 20 Prozent und mehr der Zeckenpopulation aus) und der Häufigkeit mit der Hunde jedes Jahr von Zecken gestochen werden, betrachtet, versteht man, wie schwierig die Diagnostik der Borreliose beim Hund ist. Unbestritten ist, dass es eine durch B. burgdorferi verursachte Erkrankung gibt. Allerdings muss man darauf hinweisen, dass es auch Berichte aus den USA gibt (Levy und Magnarelli 1992), nach denen von ~50 Prozent seropositiver Hunde in einem endemischen Gebiet, lediglich fünf Prozent klinische Symptome wie Lahmheit, Gelenkschwellung und Apathie zeigten. Hinzu kam, dass innerhalb des Beobachtungszeitraumes (20 Monate) ebensoviele seronegative Hunde vergleichbare Symptome entwickelten.

Jacobsen et al. (1996) konnten feststellen, dass alle Hunde mit einer für die Borreliose typischen Symptomatik bereits einen deutlichen IgG-Titer hatten. Deshalb erscheint folgende Vorgehensweise bei einem Verdacht auf Borreliose beim Hund sinnvoll:

Verdächtiges klinisches Bild (zum Beispiel wechselnde Lahmheit) unter weitgehendem Ausschluss möglicher Differentialdiagnosen und evtl. anamnestischem Hinweis auf massiven Zeckenbefall (vor ca. zwei Monaten):

IgG-Bestimmung im IFT (oder EIA) bei grenzwertigem IgG-Titer zwischen 1:40 und 1:80, Kontrollle mittels Immunoblot

Bei Titern über 1:80 oder grenzwertigem IgG-Titer und deutlich positivem Immunoblot Antibiotika-Therapie mit entsprechender klinischer Erfolgskontrolle

Trotz dieser Vorgehensweise kann die Serologie nur ein Hilfsmittel zur Diagnose sein. Letztendlich bleibt die Entscheidung einer Therapie beim behandelnden Tierarzt/-ärztin, der das klinische Bild und die entsprechende Anamnese kennt. Vorsichtig interpretiert werden müssen auch Symptome wie ZNS-Störungen, Herzblock oder Nierenschädigungen. Es liegen bisher meiner Meinung nach zu wenig Daten bezüglich dieser Krankheitsbilder im Zusammenhang mit einer Borreliose beim Hund vor.

Auch die Frage, ob man bei serologisch positivem Befund ohne klinische Symptome eine Antibiose empfehlen kann, muss der/die behandelnde Tierarzt/-ärztin nach oben genannten Ausführungen selbst entscheiden. Bei der Vielzahl serologisch positiver Hunde ohne klinische Symptomatik und dem deutlichen Hinweis, dass B. burgdorferi evtl. trotz Antibiotika-Therapie persistieren kann (Straubinger et al., 1997) halte ich persönlich eine grundsätzliche Antibiotika-Therapie nicht für sinnvoll.

Die Borreliose, nicht nur beim Hund, wird auch in näherer Zukunft noch genügend Anlass zur Diskussion geben. Es bleibt zu hoffen, dass kommende Untersuchungen spezifischer auf die Bedeutung von Borrelia burgdorferi sensu lato bei den einzelnen Tierarten, vor allem in Europa, eingehen.

Nicht-Veterinärmediziner sollten sich in jedem Fall mit Ihrem Tierarzt/mit Ihrer Tierärztin beraten.